青蒿琥酯通过调节 cAMP 和 PI3K/MAPK 通路对人血小板的抗血栓作用
by Shin-Sook Yoon 1,Hyuk-Woo Kwon 2,Jung-Hae Shin 3,Man Hee Rhee 3ORCID,Chang-Eun Park 1,4 andDong-Ha Lee 1,4,*
1.南首尔大学生物医学实验室科学系, 天安 31020, 韩国
2.远东大学生物医学实验室科学系, 阴城 27601, 韩国
3.国立庆北大学兽医学院兽医系, 大邱 41566, 韩国
4.南首尔大学分子诊断研究所, 天安 31020, 韩国
学术编辑：Ángel García 和 Alice Pollitt
诠释。J.摩尔。科学。 2022 年，23 (3)，1586；https://doi.org/10.3390/ijms23031586
收稿日期：2021 年 12 月 23 日 / 修订日期：2022 年 1 月 26 日 / 接受：2022 年 1 月 27 日 / 发布时间：2022 年 1 月 29 日
（这篇文章属于特刊血小板在人类健康和疾病中的作用）
摘要
血小板的正常激活及其聚集对于适当的止血至关重要。看来，血小板过度或异常聚集可能会导致心血管疾病，如中风、动脉粥样硬化和血栓形成。因此，寻找一种能够调节血小板聚集或抑制聚集的物质将有助于心血管疾病的预防和治疗。青蒿琥酯是从蒿属或东莨菪属植物根中提取的化合物，并且它的作用已被证明在抗癌和阿尔茨海默病领域是有希望的。然而，目前尚不清楚青蒿琥酯影响血小板聚集和血栓形成的作用和机制。本研究探讨了青蒿琥酯对 U46619 诱导的血小板聚集和血小板血栓形成的影响方式。结果，相对于剂量，青蒿琥酯以及磷酸化血管扩张剂刺激的磷蛋白 (VASP) 和肌醇 1,4,5-三磷酸受体显着增加了环磷酸腺苷 (cAMP) 和环磷酸鸟苷 (cGMP) 的产生。 IP 3 R)，cAMP依赖性激酶和cGMP依赖性激酶的底物，以显着方式。钙2+，通常从致密的肾小管系统调动，由于青蒿琥酯的 IP 3 R 磷酸化而受到抑制，并且磷酸化的 VASP 通过 αIIb/β 3血小板膜失活和抑制纤维蛋白原结合有助于抑制血小板活性。此外，青蒿琥酯显着抑制 MAPK 和 PI3K/Akt 磷酸化，导致 TXA 2的产生和细胞内颗粒分泌（血清素和 ATP 释放）减少。因此，我们认为青蒿琥酯具有作为通过抗血小板机制抑制血小板聚集和血栓形成的物质的价值。
一、简介
在世界范围内，最普遍的死亡原因是心血管疾病 (CVD)。美国报告说，七分之一的死亡是由于冠心病，九分之一的死亡是由于心力衰竭[ 1 ]。血小板的作用是在血管损伤后维持止血和防止失血的血栓形成中发挥重要作用。然而，血小板的过度活化和聚集是血栓形成的主要原因，导致心血管疾病，如冠状动脉疾病、动脉粥样硬化、心力衰竭和中风 [ 2 ]。
通过药物抑制血小板可显着降低血栓事件，而心血管疾病的治疗和预防则使用此类临床药物。不幸的是，这些药物可能会引起并发症和副作用，例如胃出血、再生障碍性贫血，甚至血小板减少症，通常会使益处最小化。因此，它们需要开发最小的预防或治疗替代方案 [ 3 ]。除了针对药物相关并发症、心血管疾病相关问题和血栓形成相关疾病的基于抗血小板药物的治疗方案外，由于天然生物活性化合物及其在医学上的应用，天然产物的使用引起了极大的兴趣治疗心血管疾病的防治[ 4]。同样，许多天然产品，例如来自地中海的传统饮食和药用植物，在预防（原发性和继发性）心血管疾病方面显示出抗血小板和心脏保护特性[ 5、6、7 ]。
抗血小板药物茶碱和维拉帕米通过增加环磷酸腺苷 (cAMP) 水平 [ 8 ] 来减少适当血小板聚集所需的 [Ca 2+ ] i量。此外，使用血管扩张剂（硝普钠和莫西多明）和 cGMP 磷酸二酯酶（PDE）抑制剂（扎普司特和 erythro-9-（2-羟基-3-壬基）腺嘌呤）会增加血小板中的环磷酸鸟苷（cGMP）水平。9 ]。前列腺素 I 2一氧化氮在正常血液循环过程中从血管内皮细胞中释放出来，导致血小板产生cAMP和cGMP。增加 cAMP 和 cGMP 水平分别导致蛋白激酶 A (PKA) 和蛋白激酶 G (PKG) 激活。已知 PKG 和 PKA 会引起底物蛋白血管扩张剂刺激的磷蛋白 (VASP) 和肌醇 1、4、5-三磷酸受体 (IP 3 R) [ 10 ] 的磷酸化。IP 3 R的磷酸化通过使 IP 3 R 失活来抑制 Ca 2+从致密管状系统募集到细胞质中[ 11]。在血小板中，VASP 是 PKG 和 PKA 的主要底物，有助于调节 αIIb/β3 活化和肌动蛋白丝的活性。当 cGMP 依赖性 VASP Ser239 和 cAMP 依赖性 VASP Ser157 被磷酸化时，αIIb/β 3的激活和肌动蛋白丝的伸长被抑制 [ 12 , 13 ]。因此，IP 3 R 一旦被磷酸化，就可以证实抑制 Ca 2+动员的抗血小板作用，而磷酸化的 VASP 通过抑制 αIIb/β 3来抑制血小板活性。
此外，通过颗粒分泌释放的 ATP 和 5-羟色胺等物质在血小板聚集中很重要，并且已知参与磷蛋白的磷酸化，例如丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 和 PI3K/Akt [ 14 ]。磷酸化酶 MAPK 称为 p38 MAPK、c-Jun N 末端激酶 (JNK) 和细胞外信号调节激酶 (ERK)。在止血和血栓形成中，MAPK 的作用已被彻底研究，并且已知它们在细胞内信号传导中起作用 [ 15 ]。据报道，MAPK 与多种激动剂发生反应并通过被磷酸化显示出活性，它通常存在于人类血小板中[ 16、17、18]。这种信号转导分子一旦被磷酸化，就被公认为在刺激血小板颗粒分泌中起着至关重要的作用 [ 19 , 20 ]。此外，已知 MAPK可使细胞膜中的cPLA 2磷酸化，然后导致 TXA 2增加，从而导致血小板进一步活化和聚集 [ 21 , 22 ]。此外，PI3K/Akt 通路已被证明有助于血小板功能调节，包括血小板中致密颗粒分泌和整体血小板聚集等行为 [ 23 ]。因此，抑制磷酸化的 PI3K/Akt 有助于评估具有抗血小板作用的物质或成分。
青蒿琥酯是青蒿素主要活性成分中青蒿素的半合成衍生物，是一种具有低毒耐受性的新型抗疟药[ 24 ]。此外，青蒿琥酯显示出抗肿瘤活性，并在临床实践中成功用于治疗转移性黑色素瘤患者[ 24 ]。早期的研究表明，青蒿琥酯可增加细胞内氧自由基的产生，并干预核因子 (NF)-κB- 和磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸 3-激酶/Akt 介导的信号通路，对 DNA 产生损伤，并且它具有据报道会干扰细胞周期调节和转移 [ 25 , 26]。据报道，青蒿琥酯可通过显着减少中风（脑梗塞）的数量和促进神经功能恢复来提高患者的生存率 [ 27 ]。据报道，青蒿琥酯降低了COX-2抑制人胃癌细胞生长和诱导细胞凋亡的能力。COX-2 是一种功能和形式与 COX-1 相似的同工酶，其作用是在血小板代谢中产生 TXA 2 。事实上，广泛用作抗血小板药物的阿司匹林等非甾体抗炎药具有抑制 COX-1 和 COX-2 的功能 [ 28 ]。此外，据报道，青蒿琥酯的类似物青蒿素可抑制炎症，同时还可抑制 MAPK 通路 [ 29]。MAPK 活性的抑制是抗血小板物质的特征，因为它与血小板分泌的抑制有关 [ 30 ]。
目前，青蒿琥酯在血小板活化和血小板聚集过程中的作用和机制仍有待发现。为了了解青蒿琥酯的抗血小板作用，我们通过通过调节 PI3K/Akt 和 MAPK 来检查循环核苷酸的调节，研究了青蒿琥酯对钙动员和颗粒分泌的影响。此外，我们探讨了青蒿琥酯是否最终参与血小板聚集和血栓形成。如果青蒿琥酯被证明是有效的抗血小板药物，则建议青蒿琥酯可用于预防血栓形成相关的 CVD。
结果
2.1。青蒿琥酯对 U46619 诱导的血小板聚集的影响
U46619（一种诱导血小板聚集的 TXA 2类似物）的最大聚集诱导浓度为0.5 µM，本实验中使用 0.5 µM U46619 诱导聚集（图1A）。将血小板与 0.5 µM U46619 和 0.1% DMSO 混合后，为了开始聚集，聚集率达到 80.5 ± 2.1%（载体对照），这与没有 0.1% DMSO 时诱导聚集的结果没有显着差异。当添加不同浓度的青蒿琥酯（50 至 200 μM）时，未观察到细胞毒性（数据未显示）。结果表明，青蒿琥酯抑制了聚集（图1B）。此时青蒿琥酯的半数最大抑制浓度（IC50）为105.26 μM（图1C)。作为阳性对照，将抗血小板物质替格瑞洛（10 μM）与血小板聚集抑制作用进行比较（图1B）。我们证实，即使在胶原蛋白和花生四烯酸诱导聚集时，青蒿琥酯也具有抑制作用（图 1B）。然而，它们对青蒿琥酯的抑制作用弱于U46619诱导的抑制作用。无论如何，这些结果表明青蒿琥酯具有有效的血小板聚集抑制作用。
图 1. 青蒿琥酯对 U46619 诱导的血小板聚集的影响。( A ) U46619 对人血小板聚集的阈值剂量。( B ) 青蒿琥酯对血小板聚集的影响。( C )青蒿琥酯对U46619诱导的血小板聚集的IC 50值。结果显示为平均值 ± SD ( n = 4)。* p < 0.05，** p < 0.001 与 U46619 诱导的车辆控制相比。
2.2. 青蒿琥酯对环状核苷酸产生的影响
确定了青蒿琥酯对 cGMP 或 cAMP 产生的影响，已知其在血小板活化中具有拮抗作用。结果，如图 2A 所示，青蒿琥酯显着增加了 cAMP 的产量，从 4.23 ± 0.16 pmoL/10 8个细胞增加到 9.38 ± 0.42 pmoL/10 8个细胞。此外，青蒿琥酯没有显着增加 cGMP 产量（图2B ）。这些结果表明青蒿琥酯通过显着增加 cAMP 的产生而不是 cGMP 的产生来抑制血小板活化。
图 2. 青蒿琥酯对环核苷酸产生的影响。（一）青蒿琥酯对 cAMP 产生的影响。( B ) 青蒿琥酯对 cGMP 生产的影响。悬浮的血小板（10 8个细胞/mL）在 37 °C 下孵育，同时加入不同浓度的青蒿琥酯，然后加入 2 mM CaCl 2和 U46619 (0.5 μM) 进行刺激，持续时间为 5 分钟。通过添加 1 M HCl 终止反应，并用 cAMP 或 cGMP EIA 试剂盒测量 cGMP/cAMP。结果显示为平均值 ± SD ( n = 4)。* p < 0.05, ** p < 0.001 与 U46619 诱导的血小板相比。
2.3. 青蒿琥酯对细胞内 Ca 2+动员和 IP3R 磷酸化的影响
由于已知细胞内 Ca 2+动员（[Ca 2+ ] i）对血小板活化很重要，因此本研究证实了青蒿琥酯对 [Ca 2+ ] i的影响。图 3 A 显示 U46619 将 [Ca 2+ ] i水平从 100.3 ± 0.5 nM 增加到 611.3 ± 29.4 nM。然而，青蒿琥酯 (50200 μM) 显着降低了由 U46619 增加的[Ca 2+ ] i (图 3 A)。然而，青蒿琥酯（50200 μM）显着降低了 U46619 增加的 [Ca 2+ ]i（图 3 A）。此外，这项研究证实了青蒿琥酯对 IP 的影响3 R 磷酸化，一种调节 [Ca 2+ ] i的蛋白质。如图3B所示，青蒿琥酯 (50200 μM) 浓度依赖性地增加U46619 诱导的血小板中的IP 3 R 磷酸化。其意义是显而易见的，并在浓度高于 100 μM 时得到证实。这表明青蒿琥酯减少细胞内Ca 2+募集是由于IP 3 R 磷酸化。
图 3. 青蒿琥酯对细胞内 Ca 2+动员和 IP 3 R 磷酸化的影响。( A )青蒿琥酯对细胞内Ca 2+动员的影响。( B ) 青蒿琥酯对 IP 3 R 磷酸化的影响。在 37 °C 下，用 Fura 2-AM (5 μM) 孵育 PRP 60 分钟，并通过上述步骤制备悬浮血小板 (10 8个细胞/mL)。洗涤的血小板在 37 °C 下用 2 mM CaCl 2和 U46619 (0.5 μM) 刺激孵育 3 分钟，持续 5 分钟。BioTeck Instrument 的分光荧光计测量了 Fura 2 荧光。结果显示为平均值 ± SD (n = 4)。a p < 0.05 与未刺激的血小板相比，* p < 0.05，** p < 0.001 与 U46619 诱导的血小板相比。
2.4. 青蒿琥酯对 VASP 磷酸化和纤维蛋白原结合的影响
由于青蒿琥酯增加了 U46619 诱导的血小板中 cAMP 的产生（图 3），我们检测了青蒿琥酯对 U46619 诱导的血小板中 cGMP 依赖性 VASP Ser239 和 cAMP 依赖性 VASP Ser157 磷酸化的影响。如图 4所示，青蒿琥酯显着增加了 VASP Ser157，但 VASP Ser239 没有。特别是，结果证实，在 100 μM 或更高时，显着性很明显，这表明青蒿琥酯增加的 cAMP 产生显着增加了 VASP Ser157 磷酸化。
图 4. 青蒿琥酯对 VASP 磷酸化的影响。使用 1× 裂解缓冲液终止反应。BCA 蛋白试剂盒测量血小板裂解物中的蛋白浓度。将来自 4-20% SDS-PAGE 的分离蛋白（20 μg）转移到 PVDF 膜上。一抗以 1:1000 的稀释倍数处理，二抗以 1:2000 的稀释倍数处理。结果显示为平均值 ± SD ( n = 4)。a p < 0.05 与未刺激的血小板相比，* p < 0.05，** p < 0.001 与 U46619 诱导的血小板相比。
由于青蒿琥酯通过增加 cAMP 的产生而增加了 VASP Ser157 磷酸化，本研究证实了青蒿琥酯对纤维蛋白原与 αIIb/β 3结合率的影响。查看图 5 A，M1 是指显示高于标准荧光的细胞部分，是指与纤维蛋白原结合的细胞。U46619 将纤维蛋白原与 αIIb/β 3的结合增加至 77.1 ± 1.1%（图 5 A(b)、B)。然而，青蒿琥酯对纤维蛋白原结合的抑制以浓度依赖性方式得到证实。此外，青蒿琥酯（200 μM）的确认抑制率为75.4%（图5 A（f），B）。
图 5. 青蒿琥酯对纤维蛋白原结合的影响。( A ) 流式细胞仪对纤维蛋白原结合的直方图。( a ) 完整的血小板（基础）；( b ) U46619 (0.5 μM)；( c ) U46619 (0.5 μM) + 青蒿琥酯 (50 μM)；( d ) U46619 (0.5 μM) + 青蒿琥酯 (100 μM)；( e ) U46619 (0.5 μM) + 青蒿琥酯 (200 μM)；( f ) U46619 (0.5 μM) + 青蒿琥酯 (300 μM)。( B ) 青蒿琥酯对 U46619 诱导的纤维蛋白原结合 (%) 的影响。通过向悬浮的血小板 ( 10 8细胞/mL)，U46619 (0.5 μM) 用于刺激持续时间为 5 分钟。加入含有 0.5% 多聚甲醛的磷酸盐缓冲盐水 (PBS, pH 7.4) 后，终止反应。在此过程中使用光阻，流式细胞仪 (FACS) 测量纤维蛋白原结合。结果显示为平均值 ± SD ( n = 4)。a p < 0.05 与未刺激的血小板相比，* p < 0.05，** p < 0.001 与 U46619 诱导的血小板相比。
2.5. 青蒿琥酯对TXA 2产生和颗粒分泌的影响
青蒿琥酯对 TXA 2产生的影响得到了证实，TXA 2 是一种放大血小板聚集的自体物质。如图 6A所示，TXA 2产量（在完整细胞中为 2.97 ± 0.81 ng/10 8个细胞）被 U46619增加到 48.93 ± 5.41 ng/10 8个细胞。然而，青蒿琥酯（50、100、150 和 200 μM）将 TXA 2产量分别显着降低至 39.44 ± 1.28、22.30 ± 6.20、13.90 ± 0.89 和 10.70 ± 2.89 ng/10 8个细胞（图 6A）。
图 6. 青蒿琥酯对 TXA 2产生和颗粒分泌的影响。( A ) 青蒿琥酯对 TXA 2产生的影响。（乙）青蒿琥酯对 ATP 释放的影响。( C ) 青蒿琥酯对血清素释放的影响。3 分钟，悬浮血小板（10 8个细胞/mL）在 37° 下以不同的青蒿琥酯浓度孵育，然后将 2 mM CaCl 2添加到 U46619（0.5 μM）中以刺激持续时间为 5 分钟。一旦反应停止，通过每个 EIA 试剂盒测量 TXA 2和颗粒分泌物。结果显示为平均值 ± SD ( n = 4)。一个 _< 0.05 与未刺激的血小板相比，* p < 0.05，** p < 0.001 与 U46619 诱导的血小板相比。
青蒿琥酯对与血小板聚集有关的 ATP 和血清素释放的影响已被证实为血小板颗粒释放的指标。结果，U46619 (0.5 μM) 将 ATP 释放从完整细胞中的 0.16 ± 0.02 μM 增加到 7.81 ± 0.15 μM（图 6 B）；然而，增加的 ATP 释放被青蒿琥酯（50、100、150 和 200 μM）显着抑制。此外，U46619 (0.5 μM) 将血清素释放量从完整细胞中的 8.65 ± 0.58 ng/10 8个细胞增加到 150.36 ± 1.30 ng/10 8个细胞。然而，青蒿琥酯（50、100、150 和 200 μM）减少了由 U46619 增加的 5-羟色胺的释放，分别为 139.70 ± 3.63、111.87 ± 12.94、95.39 ± 2.90 和 35.66 ± 3.57 ng/10 8个细胞（图 6C）。这些结果表明青蒿琥酯显着抑制颗粒分泌。由于已知 ATP 和 5-羟色胺在致密颗粒中含量丰富，因此可以预期青蒿琥酯与致密颗粒中的脱颗粒有关。然而，仅从这项研究的结果很难清楚地解释青蒿琥酯是否还参与了 α 颗粒的脱颗粒。
2.6. 青蒿琥酯对 PI3K/Akt 和 MAPK 磷酸化的影响
青蒿琥酯对 PI3K/Akt 磷酸化（一种参与血小板颗粒释放的磷蛋白）的影响已得到证实。如图 7A 所示，与完整细胞相比，U46619 显着增加了 PI3K 和 Akt 磷酸化。然而，U46619 增加的 PI3K/Akt 磷酸化被青蒿琥酯显着降低（图 7A），表明青蒿琥酯抑制了由 U46619 引起的 PI3K/Akt 磷酸化。
图 7. 青蒿琥酯对 PI3K/Akt 和 MAPK 磷酸化的影响。( A ) 青蒿琥酯对 PI3K/Akt 磷酸化的影响。( B )青蒿琥酯对MAPK磷酸化的影响。使用 1× 裂解缓冲液终止反应。BCA 蛋白试剂盒测量血小板裂解物中的蛋白浓度。通过 4-20% SDS-PAGE 分离的蛋白质（20 μg）被转移到 PVDF 膜上。一抗以 1:1000 的稀释倍数处理，二抗以 1:2000 的稀释倍数处理。结果显示为平均值 ± SD ( n = 4)。a p < 0.05 与未受刺激的血小板相比，* p < 0.05，** p< 0.001 与 U46619 诱导的血小板相比。
确定了青蒿琥酯对 MAPK (p38, ERK, JNK) 磷酸化的影响，涉及血小板中颗粒的释放和 TXA 2的产生。如图7B 所示，与完整细胞相比，U46619 显着增加了 p38 磷酸化，但 ERK 和 JNK 磷酸化未受到显着影响。此外，青蒿琥酯显着抑制 JNK 和 p38 磷酸化（图7B）。这表明，通过抑制 p38 和 JNK (MAPK) 磷酸化，血小板聚集的信号传导过程受到青蒿琥酯的调节。
2.7. 青蒿琥酯对血小板介导的纤维蛋白凝块收缩的影响
血小板活化和聚集通过血小板诱导剂发生，随着时间的推移，通过外部途径的信号转导导致纤维蛋白凝块的形成。因此，本研究调查了青蒿琥酯通过凝血酶诱导对血小板介导的纤维蛋白凝块收缩的影响。如图 8A 所示，凝血酶强烈形成纤维蛋白凝块，青蒿琥酯（50、100 和 200 μM）浓度依赖性地抑制凝血酶诱导的纤维蛋白凝块收缩。青蒿琥酯（50、100 和 200 μM）的抑制率分别确认为 11.7%、37.8% 和 58.8%（图8B ）。这些结果表明青蒿琥酯实际上可以抑制血栓形成。
图 8. 青蒿琥酯对血小板介导的纤维蛋白凝块收缩的影响。( A ) 青蒿琥酯对凝血酶收缩的纤维蛋白凝块照片的影响。( B ) 青蒿琥酯对凝血酶收缩的纤维蛋白凝块面积的影响。为避免粘连，聚乙烯管含有 PRP (500 μL)，并在 37 °C 的温度和 15 分钟的时间通过凝血酶 (0.05 U/mL) 和 2 mM CaCl 2进一步刺激。然后数码相机拍摄了血小板介导的纤维蛋白凝块的照片。结果显示为平均值 ± SD ( n = 4)。a p < 0.05 与未刺激的血小板相比，* p < 0.05，** p < 0.001 与凝血酶诱导的血小板相比。
讨论
在血小板膜上，磷脂酰肌醇 4,5-二磷酸 (PIP 2 ) 被磷脂酶 C-γ 2 (PLC -γ 2 ) 水解，产生二酰基甘油 (DG) 和肌醇 1,4,5-三磷酸 (IP 3 )。来自 PIP 2降解的 IP 3导致细胞内 Ca 2+动员 ([Ca 2+ ] i ) 从致密管状系统进入胞质溶胶，并被 DG 依赖性蛋白激酶 C (PKC) [ 31 ] 激活。[Ca 2+ ] i的增加导致肌球蛋白轻链和 pleckstrin (Ca 2+/钙调蛋白依赖性蛋白）在血小板聚集过程中被磷酸化 [ 32 ]。
具有相反作用的环核苷酸（cGMP 和 CAMP）显示出通过 cGMP 依赖性蛋白激酶 (PKG) 和 cAMP 依赖性蛋白激酶 (PKA)降低 [Ca 2+ ] i和抑制血小板聚集的能力 [ 33 ]。在这项研究中，青蒿琥酯显着增加血小板中 cAMP 的产生并引起 [Ca 2+ ] i抑制。结果表明，青蒿琥酯增加的 cAMP 通过下调 [Ca 2+ ] i在血小板活化抑制中起重要作用。. 当 cAMP 增加时，通过 PKA 激活磷酸化多种底物，更具体地说，已知会影响肌醇 1,4,5-三磷酸受体 (IP 3 R) [ 10 ] 的磷酸化。如图 3 B所示，青蒿琥酯增加了 IP 3 R的浓度依赖性磷酸化。这意味着青蒿琥酯对 PKA 的激活导致了 IP 3 R 的磷酸化，从而导致抑制 Ca 2+通道开放（位于密集的管状系统），从而减少 [Ca 2+ ] i. 此外，青蒿琥酯产生的 cAMP 增加导致血管扩张剂刺激的磷蛋白 (VASP) 通过激活 PKA 被磷酸化。VASP 是 cAMP/cGMP 依赖性激酶 (PKA/PKG) 的重要底物，通过调节粘附特性和血小板分泌来帮助调节血小板活化，而 VASP 磷酸化已显示通过抑制整合素的活化来抑制血小板的聚集αIIb/β 3 [ 34 , 35 ]。
在这项研究中，青蒿琥酯强烈抑制U46619 诱导的血小板中纤维蛋白原与 αIIb/β3 的结合。据认为，青蒿琥酯增加的 cAMP 产生导致 PKA 和磷酸化 PKA 依赖性 VASP Ser157 的激活，这导致纤维蛋白原与 αIIb/β 3的结合受到抑制。未来，需要进一步研究青蒿琥酯导致 cAMP 产量增加的机制。已知 cAMP 和 cGMP 依赖于腺苷酸环化酶/鸟苷酸环化酶或环核苷酸磷酸二酯酶 (PDE) 激活 [ 36]。由于 PDE 活性抑制导致血小板聚集过程中环核苷酸水平增加，因此 PDE 抑制剂已被证明对血栓形成具有治疗作用 [ 37 ]。事实上，PDE 抑制剂（西洛他唑、双嘧达莫和三鲁沙）已作为抗血小板药物在临床上增加环核苷酸的产生 [ 9 ]。人们认为青蒿琥酯可以开发为具有类似功能的抗血小板药物。
此外，PI3K/Akt 的通路在血小板被激活时在细胞内信号传导过程中起作用的磷蛋白中被注意到，它们的磷酸化在血小板功能调节过程中起主要作用，例如血小板聚集和致密颗粒分泌 [ 23 ]。此外，丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 是众所周知的磷蛋白，包括 p38 MAPK、c-Jun N-末端激酶 (JNK) 和细胞外信号调节激酶 (ERK)，并参与活化和聚集血小板 [ 22 ]。在人血小板中发现，MAPK 在激动剂激活的血小板后通过磷酸化被激活 [ 17 , 18]。根据 Mei-Chi 等人的说法，磷酸化 MAPK（如 p38）对于花生四烯酸释放（TXA 2 的前体）和 TXA 2生成至关重要，这会导致血小板聚集 [ 38 ]。对评估参与抑制血小板活性的物质或成分很重要的一个指标是 TXA 2的生成，因为它能够充当强大的自体物质，导致额外的血小板活化和聚集。因此，抑制 TXA 2产生的物质，例如奥扎格雷或阿司匹林，是一种有用的抗血小板化合物 [ 19 , 38 ]。
在这项研究中，青蒿琥酯对某些激动剂（U46619、胶原蛋白、花生四烯酸）特别是 U46619 诱导的血小板聚集显示出显着的浓度依赖性抑制作用。特别是，在 U46619 诱导的聚集中，青蒿琥酯的 IC50 为 105.26 µM。然而，由于这是在处理洗涤过的血小板时获得的结果，因此在实际给药时需要解释多少是有限度的。此外，考虑到小鼠鼻内给予青蒿琥酯治疗疟疾的情况，可以看出 15 分钟内几乎全部被吸收并存在于血液中，但 15 分钟后减少了一半 [ 39]。事实上，当给予人类时，预计需要给予更高浓度的青蒿琥酯，考虑到青蒿琥酯的半衰期和活性都会因与血液中存在的血浆蛋白结合而降低. 然而，这项研究对于阐明青蒿琥酯发挥抗血小板作用的机制具有重要意义。测量了青蒿琥酯对 TXA 2产生和颗粒分泌（血清素和 ATP 释放）的影响，这些是血小板聚集的重要标志物。此外，我们试图阐明青蒿琥酯与 PI3K/Akt 和 MAPK 磷酸化的关系。结果，确定青蒿琥酯抑制了强烈增加的 TXA 2用 U46619 生产，并且由于青蒿琥酯，血清素和 ATP（细胞内颗粒分泌指标）的释放显着降低（图 6）。此外，结果证实 PI3K/Akt 和 MAPK 磷酸化，即用于颗粒分泌调节的信号转导磷蛋白，被青蒿琥酯显着抑制。据认为，青蒿琥酯可抑制磷蛋白（PI3K/Akt 和 MAPK）的磷酸化，从而通过减少 TXA 2的产生和颗粒的细胞内分泌（血清素和 ATP 释放）来抑制血小板的聚集。
此外，增加的整合素αIIb/β 3介导的信号转导和颗粒释放通常会改变血小板的细胞骨架，影响血小板的聚集和血栓的形成。血栓形成是修复受损血管的最重要步骤，在此期间，活化的血小板积聚并形成纤维蛋白和血小板的网状结构。当纤维蛋白凝块形成时，它开始收缩 30 到 60 分钟，最终形成血栓栓塞。纤维蛋白凝块的回缩在很大程度上依赖于纤维蛋白原和 αIIb/β3的相互作用，而 αIIb/β3 活性的抑制剂已被证明可以防止血栓的形成 [ 40]。为了增加纤维蛋白原结合αIIb/β 3的能力，凝血酶诱导凝血和血小板αIIb/β 3活化，导致凝块血栓形成。如图 9 所示，青蒿琥酯的抗血小板作用导致相对于浓度抑制凝血酶诱导的纤维蛋白凝块，这是抑制血栓形成的真正结果。这里的结果表明青蒿琥酯具有作为抑制血栓形成的强效抗血小板物质的潜力。
图 9. 青蒿琥酯对血小板细胞内信号通路的抑制作用示意图。
总之，青蒿琥酯增加人血小板中的 cAMP 以诱导 IP 3 R 和 VASP 磷酸化，从而显着抑制 Ca 2+的募集和整合素 αIIb/β 3进入细胞质的激活。此外，青蒿琥酯已被证明通过调节作用于信号转导的磷蛋白（如 PI3K/Akt 和 MAPK）的磷酸化来抑制颗粒释放，从而表现出抗血小板功能。最后，凝血酶诱导的纤维蛋白凝块的产生被显着抑制。因此，我们认为青蒿琥酯具有作为通过抗血小板机制抑制血小板聚集和血栓形成的物质的价值。
四、材料与方法
4.1。材料
Avention Corporation（韩国仁川）提供青蒿琥酯（图 9）。U46619 和凝血酶购自 Chrono-Log Corporation (Havertown, PA, USA)。TXB 2酶免疫测定 (EIA) 试剂盒、血清素 EIA 试剂盒、ATP 测定试剂盒以及 cAMP 和 cGMP EIA 试剂盒可在 Cayman Chemical Co. (Ann Arbor, MI, USA) 获得。Invitrogen Molecular Probes (Eugene, Orlando, FL, USA) 提供了 Fibrinogen Alexa Fluor 488 偶联物和 Fura 2-AM。Sigma Chemical Corporation (St. Louis, MO, USA) 提供其他试剂。蛋白质印迹裂解缓冲液和抗体由 Cell Signaling (Beverly, MA, USA) 提供。Thermo Fisher Scientific（韩国首尔）提供了增强的化学发光溶液和聚偏二氟乙烯膜。
4.2. 人洗血小板的制备
从提供知情同意的健康志愿者那里采集的人富含血小板血浆 (PRP) 从韩国红十字血液中心 (KRBC, Suwon, Korea) 获得，其实验用途得到了 KRBC 和南首尔大学机构审查委员会的批准（1041479-HR-201803-003，2015 年 4 月 23 日）。先前进行的方法用于制备悬浮血小板 [ 41 ]。10 分钟，PRP 以 1300× g离心收集血小板，然后用缓冲液（pH 6.9、2.7 mM KCl、138 mM NaCl、12 mM NaHCO 3、0.36 mM NaH 2 PO 4、1 mM Na 2 EDTA 和 5.5 mM 葡萄糖）。悬浮缓冲液（pH 7.4、2.7 mM KCl、138 mM NaCl、12 mM NaHCO 3、0.49 mM MgCl 2、0.36 mM NaH 2 PO 4、5.5 mM 葡萄糖、0.25% 明胶）悬浮血小板（最终浓度为10 8个细胞/mL）。通过在 25 °C 下执行所有程序来避免血小板聚集。
4.3. 血小板聚集测量
在 37 °C 下孵育 3 分钟，同时加入不同浓度的青蒿琥酯，培养悬浮的血小板 (10 8个细胞/mL)。然后，加入 2 mM CaCl 2和 U46619 (0.5 μM) 进行刺激，持续时间为 5 分钟。凝集计（Chrono-Log Co., Havertown, PA, USA）在 1000 rpm 的搅拌速度下测量实验，随着透光率的增加计算凝集率。以悬浮缓冲液0%的悬浮渗透率作为参考值。青蒿琥酯用浓度为0.1%的二甲基亚砜（DMSO）溶解，所有试验均加入相同剂量的DMSO。
4.4. 细胞毒性测量
确认从细胞质中释放乳酸脱氢酶 (LDH) 确定了细胞毒性。在室温下加入不同浓度的青蒿琥酯孵育悬浮的血小板（10 8个细胞/mL）两小时，然后以 12,000× g离心 2 分钟。协同 HT 多阅读器（BioTek Instruments，Winooski，VT，USA）用 LDH EIA 试剂盒测量上清液。
4.5. 环状核苷酸（cAMP 和 cGMP）生产测量
3 分钟，悬浮血小板（10 8个细胞/mL）在 37 °C 下孵育，同时加入不同浓度的青蒿琥酯，然后加入 2 mM CaCl 2和 U46619（0.5 μM）以刺激持续时间 5 分钟。通过添加 1 M HCl 终止反应，Synergy HT Multi-Reader (BioTek Instruments, Winooski, VT, USA) 使用 cAMP 或 cGMP EIA 试剂盒测量 cGMP/cAMP。
4.6. 细胞内 Ca 2+动员测量
PRP 与 Fura 2-AM (5 μM) 在 37 °C 下孵育 60 分钟，根据上述步骤制备悬浮血小板 (10 8个细胞/mL)。洗涤的血小板在 37 °C 下用 2 mM CaCl 2和 U46619 (0.5 μM) 刺激孵育 3 分钟，持续 5 分钟。BioTeck Instrument (Winooski, VT, USA) 的分光荧光计 (SFM 25, USA) 测量了 Fura 2 荧光。用 340 和 380 nm 的激发波长和 510 nm 的发射波长分析荧光。使用 Grynkiewicz [ 42 ]的方法计算动员的 Ca 2+的量。
4.7. 纤维蛋白原结合测量
通过向悬浮的血小板（10 8个细胞/mL）中加入 2 mM CaCl 2用 Alexa Fluor 488-人纤维蛋白原（30 μg/mL）处理后，使用 U46619（0.5 μM）进行刺激，持续时间为 5 分钟。添加含有 0.5% 多聚甲醛的磷酸盐缓冲盐水 (PBS, pH 7.4) 终止反应。在该过程中使用了光阻，并且来自 BD Bioscience (San Jose, CA, USA) 的流式细胞仪 (FACS) 测量了纤维蛋白原的结合。软件 Cell-Quest (BD Biosciences) 用于分析。
4.8. TXB 2生产测量
3 分钟，悬浮血小板（10 8个细胞/mL）在 37 °C 下孵育，同时加入不同浓度的青蒿琥酯，然后加入 2 mM CaCl 2和 U46619（0.5 μM）以刺激持续时间 5 分钟。Synergy HT 多阅读器（BioTek Instruments，Winooski，VT，USA）使用 TXB 2 EIA 试剂盒测量了 TXB 2（一种稳定的 TXA 2代谢物）的产生。
4.9. ATP 和血清素释放测量
3 分钟，悬浮血小板（10 8个细胞/mL）在 37° 下以不同的青蒿琥酯浓度孵育，然后加入 2 mM CaCl 2和 U46619（0.5 μM）进行刺激，持续时间为 5 分钟。一旦用冰冷的 2 mM EDTA 停止反应，协同 HT 多阅读器（BioTek Instruments，Winooski，VT，USA）和血清素或 ATP EIA 试剂盒测量由于离心而在上层释放的血清素/ATP。通过在聚集反应后通过离心测量上层中的ATP或血清素来确认血小板中颗粒物质分泌到细胞外的程度。
4.10。西方免疫印迹测量
使用 1× 裂解缓冲液终止反应。使用 BCA 蛋白试剂盒（Pierce Biotechnology，Rockford，IL，USA）测量来自血小板裂解物的蛋白浓度。通过 4-20% SDS-PAGE 分离蛋白质（20 μg）并转移到 PVDF 膜上。一抗以 1:1000 的稀释倍数处理，二抗以 1:2000 的稀释倍数处理。使用 ECL 试剂 (Thermo Fisher Scientific, Gangnam-gu, Seoul, Korea) 进行可视化。
4.11。血小板介导的纤维蛋白凝块收缩测量
为了避免粘连，聚乙烯管含有 PRP (500 μL)，然后用凝血酶 (0.05 U/mL) 和 2 mM CaCl 2在 37 °C 的温度下刺激 15 分钟。然后数码相机拍摄了血小板介导的纤维蛋白凝块的照片。软件 ImageJ（1.46 版，美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州，美国）计算凝血面积。
4.12。统计分析
所有数据均表示为具有不同观察次数的平均值±标准差。用来自四名正常成人的血小板进行了重复实验。进行方差分析以确定组间的主要差异，并使用 Scheffe 方法。使用SPSS 21.0.0.0软件（SPSS，Chicago，IL，USA）进行统计分析，p <0.05被认为具有统计学意义。
作者贡献
概念化，D.-HL；方法论，H.-WK；形式分析，S.-SY；调查，S.-SY 和 J.-HS；资源，H.-WK、S.-SY 和 D.-HL；撰写原始草稿准备，S.-SY 和 D.-HL；写作——审查和编辑，S.-SY 和 D.-HL；可视化，MHR；监督，MHR，C.-EP；项目管理，D.-HL；资金获取，D.-HL 所有作者均已阅读并同意已发表的手稿版本。
资金
这项研究得到了韩国国家研究基金会的支持。由韩国政府资助的赠款（赠款号 NRF-2017R1C1B5075857）。
机构审查委员会声明
本研究经南首尔国立大学机构审查委员会批准（1041479-HR-201803-003，2015 年 4 月 23 日）进行。
知情同意声明
根据赫尔辛基宣言并经韩国红十字会批准，所有为本研究提供血液样本的人类受试者均获得了书面知情同意书。
数据可用性声明
不适用。
致谢
我要感谢 Sarah Chun，她在幕后支持和服务我，使这项研究成为可能。
利益冲突
作者声明没有利益冲突。
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